2 糖苷酶的分离纯化及特征研究

糖苷酶是一类与茶叶醇系香气成份形成密切相关的酶类。为研究醇系香气成份的形成机理，有必要对糖苷酶进行分离纯化及特征的研究。茶叶中糖苷酶纯化，一般经过鲜叶匀浆制成丙酮粉、有机溶剂沉淀、（NH4）2ＳＯ4盐析、柱层析及FPLC等步骤［8，16］。β?葡萄糖苷酶与β－樱草糖苷酶纯化方法基本～致，只是条件略有不同。以β－樱草糖苷酶的分离纯化为例［16］。茶鲜叶匀浆制得的丙酮粉以0．1M pH6?0的柠檬酸盐缓冲液4℃悬浮3hr后17500g离心20min，取上清液加入等体积的丙酮搅拌过夜后35000g离心20min，弃上清液。将沉淀溶解后加入饱和硫酸铵溶液，35000g离心收集40～80％硫酸铵饱和度的沉淀，透析后过CMToyopearl 650M柱层析得Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ个组分，Ⅱ组分经Diaflo膜超滤脱盐浓缩后用单SHR离子交换柱进行FPLC分离得到β－樱草糖苷酶的组分。分离得到的β－樱草糖苷酶组分用SDS，PAGE及MALDI?TOFMS方法(简称S法及M法)确定分子量，用等电点聚焦电泳测定等电点。从Cv?Yabulkita中分离出的β－樱草糖苷酶分子量为61KD（S法）或60?5 KD（M法），等电点pI 9?4［11］。从Cv?Shuixian中分离出的β－樱草糖苷酶分子量为61KD（S法）或60?2KD（M法），等电点pI 9?5［15］。

从Cv.Assamica中分离出的β－樱草糖苷酶分子量为61KD （S法）或60?2KD（M法），，等电点pI 9?5，三者基本一致。这说明在不同茶树品种中都存在作为主要醇系香气释放酶的β－樱草糖苷酶，只是不同品种间分子水平上可能有几个氨基酸残基的差异。以香叶醇、芳樟醇等的樱草糖苷为底物，检测用上述方法提纯的β－樱草糖苷酶的作用位点，结果显示β－樱草糖苷酶作用于糖基与配基连接的位点［17］，这为阐明醇系香气物质组成的分子机理提供了试验依据。

3 糖苷酶的酶促反应动力学研究

酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素。酶促反应速度是酶活力的直接体现，也就是说酶促反应速度的测定即酶的活力测定。最初水解醇系香气前驱体糖苷酶活力的研究是通过茶鲜叶匀浆、有机溶剂洗涤、干燥制得的粗酶提取物和以对?硝基苯－β－葡萄糖苷为底物进行反应，底物水解后释放出来的配基对?硝基苯酚可直接在405nm下以分光光度计测定［19］。考虑到茶鲜叶中糖苷酶的多样性，以对?硝基苯－β－葡萄糖苷为底物进行粗酶提取物的研究是一种简便、灵敏的方法，所以被广泛采用。在茶鲜叶中，糖苷与糖苷酶均具多样性，因而以茶鲜叶香气前驱体混合提取物为底物与酶作用后以GC分析香气的产生量才能如实反应酶活力的大小。然而在研究酶的活力尤其是在酶的纯化过程中若以各种香气前驱体为底物进行酶的提纯程度分析研究是不实际的。因此，一般仍然采用对硝基苯－β－葡萄糖苷或相应的?硝基苯－β－糖苷（如β－半乳糖苷酶以对硝基苯－β－半乳糖苷为底物）为底物。在糖苷酶得到提纯后，可以相应糖苷形式的香气前驱体为底物，以香气释放量为指标研究酶的活力。现已鉴定出的糖苷形式的香气前驱体中，一类是单糖苷，另一类为双糖苷。双糖苷主要为β－樱草糖苷。β－樱草糖苷酶现已得到纯化，将纯化后的酶与各种樱草糖苷的香气前驱体进行反应，它水解每一种樱草糖苷的活性与粗酶提取物的水解活性相当一致［11］，从而进一步揭示了醇系香气物质形成的糖苷酶水解机制。酶促反应速度受pH、温度、酶浓度、激活剂、抑制剂等多种因素的影响。现有研究表明β－樱草糖苷酶在pH 5 .0，50℃时活性最高，在pH5～7， 45℃以下时稳定［16］。β－半乳糖苷酶亦在pH 5.0， 50℃时活性最高，其半乳糖米氏系数km为4?2mmol／L，一价和二价阳离子对该酶活性影响不大，半乳糖为其竞争抑制剂，适当浓度的半乳糖可防止该酶因受热致钝［12］

4 糖苷酶的专一性

酶对所作用的底物有严格的选择性，即酶的专一性。糖苷酶也不例外。从茶鲜叶中已分离出香气前驱体苯甲醇β－D－吡喃葡萄糖苷［20］、（顺）?3?稀醇β－D－吡喃葡萄糖苷［21］、芳樟醇β－D?樱草糖苷［13］等均可在外源β－D－葡萄糖苷酶的作用下释放出配糖体，也就是说，β－D－葡萄糖苷酶可水解含有β－D－糖苷键的糖苷，对糖基和配基要求不严，只要求有β－糖苷键，而不严格要求键两端的基因，只是水解速度不同，这种专一称为"键专一性"。虽还未对茶鲜叶内源β－D－葡萄糖苷酶的专一性做过研究，但可预测其专一性亦为"键专一性"。樱草糖苷酶是植物中普遍存在的一类酶，它对糖苷的配糖体和糖基均具有严格的特异性［22］。以（s)-芳樟醇?β－樱草糖苷（I）、（R）-芳樟醇β－二糖苷（Ⅱ）、香叶醇-6-0-α-L阿拉伯呋喃糖基?β－D－葡萄吡喃糖苷（Ⅲ）、苯甲醇?β?樱草糖苷（Ⅳ）和苯甲醇-6-O?β、D?apiofuranosyl?β?D?glucopyranoside（Ⅴ)为底物研究茶叶中β?樱草糖苷酶的专一性，发现其对（Ⅰ）、（Ⅳ)、(Ⅴ）的水解活性很高，对（Ⅱ）、（Ⅲ）的水解活性较低［13］。初步研究表明，茶叶中的β?樱草糖苷对底物具有相对的专一性。茶树叶片中的糖苷酶底物特异性的研究是以人工合成的芳樟醇及其氧化物（LOⅠ、 LOⅡ、 LOⅢ、 LOⅣ）的?β－D－葡萄糖苷以及苯甲醇、α－苯乙醇、香叶醇、芳樟醇和P－硝基苯酚的β－樱草糖苷为底物进行的［23，24］。试验结果表明，糖苷酶水解活性以β－樱草糖苷高于β－葡萄糖苷，表现出对糖基的选择性；糖苷酶水解香叶醇，芳樟醇糖苷活性高于苯甲醇和2－苯乙醇糖苷，表现出对配基的选择性。进一步研究了糖苷酶的立体异构专一性。 LOⅠ与LOⅡ（顺式和反式呋喃型氧化芳樟醇）、 LOⅢ与LOⅣ（反式与顺式吡喃型氧化芳樟醇），互为几何异构体，糖苷酶对LOⅠ和LOⅡ无选择性， LOⅣ则优先于LOⅢ被糖苷酶释放出来，表现出一定的几何异构专一性。对光学异构体，糖苷酶对氧化芳樟醇中呋喃型和吡喃型有不同的特异性表现，是为旋光异构专一性。

5 结语

在茶叶中糖苷酶的研究是随着香气前驱体的研究开展的。茶叶中含有的多种醇系香气的糖苷在内源糖苷酶的作用下水解释放出香气，这已逐渐成为醇系香气形成的分子机理的共识。研究糖苷酶在茶树生长及加工中的变化、糖苷酶多样性的研究，糖苷酶作用机理的研究等将会更详细揭示茶的香气形成机理。尤其是乌龙茶的香气是在萎调、发酵、摇青过程中失水或碰伤时产生的，这是否是植物对逆性环境的一种应答反应尚待研究。同时，研究糖苷酶在茶树生长及加工过程中的变化规律也会为适时采滴及高香型成茶的生产提供理论依据。

参考文献

1 Kobayashi A.et al., Foods Food ingredient J. 1995,(163).70-78

2 Jae-Hak Moon.et al., Biosci. Biotech. Biochem. 1994,58(9) 1742-1744

3 Wenfei Guo, et al., Phytochemistry, 1993,33(6): 1373-1375

4 J.Moon et al. 38th Symposium on the Chemistry of Terpenes,Essential Oils and Aromatics,

Niigata, Japan, 1994:63-65 .

5 Ogawa K. et al., Z.Naturforsch, C：Biosci, 1995,50(7/8):493-498

6 Sakata k., et al. Temien Tulci kagobutse Toronkai koen Yoshishu.1996,(38):511 -516

7 Takeo T., et al., Phytochemistry, 1981,20(9):2149-2151

8 Sakata k., et al., Proc. Symp. on Plant Growth and Enviroment Suwankorea. 1993:72-83

9 Dey P.M., et al., Adv. Enzymol., 1984,56:141

10 Jyosnabaran H., et al., J.Nutr. Biochem., 1 997,8(7):378-384

11 Wenfei Guo et al., Biosci. Biotech. Biochem.,1995,59(5):962-964

12 Morita, k., et al., Biosci. Biotech. Biochem., 1994,58:687-690

13 Guo W., et al., Biosci. Biotech. Biochew., 1994,58(8):530-1534

14 Kenji Ogawa, et al., J.Agric. Food Chem., 1997,45:877-882

15 Yasuyuki lJima, et al., J.Agric. Food chem., 1998,46:1712-l718

16 Wenfei Guo, et al. Biosci. Biotech. Biochew.. 1996.60(ll):1810-l814

17 K.Sfokata, et al 13th lnternational Congress of Flavour, Fragrance　and Essential Oils.

October 15-19, 1995, Istanbul, Turkey

18 Nishikitani M., et al., Biosci Biotech. Biochem., 1996,60(5):929-931

19 Yano M. et al., Agric.Biol, Chem., 1990, 54(4):1023-1028

20 Yano M. et al., Agric Biol. chem., 1991,55(4):1205-1206

21 Kobayashi A., et al., Biosci. Biotech. Biochem. 1994,58:592-593

22 W.Hosel, et al., Trends in Biochem. Sci. 1982,(7):219-221

23 Dongmei Wang, '97中国国际茶技术与茶文化交流会：1997，5?28-30?北京，中国/中国食品工业协会，

1997，33-34

24 Matsumura S.J.Agric.Food Chem.,1997,45 2674-2678